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    委托菌種保藏服務
    中國微生物菌種查詢網 / 2016-07-12

    中國微生物菌種查詢網現依托中國微生物菌種保藏中心擁有完善的菌種保藏設備,并開拓相關保藏業務主要接受為生物安全等級2級和2級以下的微生物菌種進行保藏。要求對于菌種的用途特征特性需備注清楚。我單位只能辦理保藏的是長期保存其性狀不發生明顯變異的菌種。

    微生物菌種保藏的基本原理在保藏過程中,必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(使菌體不死、不衰、不變),在一定的時間內使其不發生變異而又保持生活能從而達到保藏目的。單位目前的保藏方法有液氮超低溫凍結法、真空冷凍干燥法、-80°C冰箱凍結法等方法實現菌種的妥善保藏。


    定期移植法

    亦稱傳代培養保藏法,包括斜面培養、穿刺培養、液體培養等。是指將菌種接種于適宜的培養基中,最適條件下培養,待生長充分后,于4~6℃進行保存并間隔一定時間進行移植培養的菌種保藏方法。

    操作步驟如下:

    1 培養基制備

    1.1 器皿準備 培養基制備過程中所用的一些玻璃器皿,如三角瓶、試管、培養皿、燒杯、吸管等,經洗滌、干燥、包裝、滅菌后使用。

    1.2 溶解培養基配料 先在燒杯中放適量水,按培養基配方稱取各項材料,依次將緩沖化合物、主要元素、微量元素、維生素等材料加入水中溶解,最后加足水量,攪拌均勻。

    1.3 調pH值 配料溶解后將培養基冷卻至室溫,根據要求加稀酸(0.1mol/L鹽酸)或稀堿(10%氫氧化鈉)調pH值。加酸或堿液時要緩慢、少量、多次攪拌,防止局部過堿或過酸而導致測量不準確和營養成分被破壞。

    1.4 加凝固劑 配制固體培養基時需加凝固劑,如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養基中,加熱并不斷攪拌至融解,再補足所蒸發水分。

    1.5 過濾分裝 在二層紗布中間夾入脫脂棉,將配好的培養基趁熱過濾并分裝。斜面培養基分裝量約為試管高度的四分之一(4~5mL),穿刺培養基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過程中勿使培養基沾污管口,以免弄濕棉塞造成污染。

    1.6 包扎標記 將試管加棉塞,外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明培養基名稱及配制日期。

    1.7 滅菌 根據要求將培養基滅菌,通常蒸汽滅菌為121℃,15~20min。

    1.8 斜面擺放 滅菌后及時擺放斜面,斜面長度不超過試管管長的二分之一為宜。

    1.9 無菌檢查 將滅菌的培養基放入培養箱中作無菌檢驗,通常30℃培養1~3天。無菌檢查合格后將其保存于4℃下備用。

    2接種

    2.1 斜面接種 2.1.1 點接 把菌種點接在斜面中部偏下方處。適用于擴散型生長及絨毛狀氣生菌絲類霉菌(如毛霉、根霉等)。 2.1.2 中央劃線 從斜面中央自下而上劃一直線。適用于細菌和酵母菌等。

    2.1.3 稀波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃“之”字形線。適用于易擴散的細菌,也適用于部分真菌。

    2.1.4 密波狀蜿蜒劃線法 從斜面底部自下而上劃密“之”字形線。能充分利用斜面獲得大量菌體細胞,適用于細菌和酵母菌等。 2.1.5 挖塊接種法 挖取菌絲體連同少量培養基,轉接到新鮮斜面上。適用靈芝等擔子菌類真菌。

    2.2 穿刺接種 用接種針從原菌種斜面上挑取少量菌體,從柱狀培養基中心自上而下刺入,直到接近管底(勿穿到管底),然后沿原穿刺途徑慢慢抽出接種針。適用于細菌和酵母菌等。 2.3 液體接種 挑取少量固體斜面菌種或用無菌滴管等吸取原菌液接種于新鮮液體培養基中。

    3 培養 將接種后的培養基放入培養箱中,在適宜的條件下培養至細胞穩定期或得到成熟孢子。細菌培養溫度一般為30~37℃,真菌培養溫度一般為25~28℃。

    4 保藏 培養好的菌種于4~6℃保存,根據要求每3~6個月移植一次。某些菌種,如芽裂酵母,阿舒假囊酵母,棉病囊霉等,須1~3個月移植一次。 保藏濕度用相對濕度表示,通常為50%~70%。

    斜面菌種應保藏相繼三代培養物以便對照,防止因意外和污染造成損失。


    -80℃ 冰箱凍結法

    將菌種保藏在-80℃冰箱中以減緩細胞的生理活動進行冷凍的一種保藏方法。

    操作步驟如下: 1 安瓿管的準備 安瓿管材料以中性玻璃為宜。清洗安瓿管時,先用2%鹽酸浸泡過夜,自來水沖洗干凈后,用蒸餾水浸泡至pH中性,干燥后、貼上標簽,標上菌號及時間,加入脫脂棉塞后,121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。

    2 保護劑的選擇和準備 保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時,應注意其濃度及pH值,以及滅菌方法。如血清,可用過濾滅菌;牛奶要先脫脂,用離心方法去除上層油脂,一般在100℃間歇煮沸2-3次,每次10-30分鐘,備用。

    3 微生物保藏物的準備 在最適宜的培養條件下將細胞培養至靜止期或成熟期,進行純度檢查后(參見科技部自然科技資源平臺聯合管理辦公室文件《微生物菌種純度檢測技術規程》(試行)),與保護劑混合均勻,分裝。微生物培養物濃度以細胞或孢子不少于108-1010個/ml為宜(以大腸桿菌為例,為了取得每毫升1010個活細胞菌液2毫升-2.5毫升,只需10毫升瓊脂斜面兩支)。采用較長的毛細滴管,直接滴入安瓿管底部,注意不要濺污上部管壁,每管分裝量約0.1-0.2毫升,若是球形安瓿管,裝量為半個球部。若是液體培養的微生物,應離心去除培養基,然后將培養物與保護劑混勻,再分裝于安瓿管中。分裝安瓿管時間盡量要短,最好在1-2小時內分裝完畢并預凍。分裝時應注意在無菌條件下操作。

    4 凍結保藏 將安瓿管或塑料凍存管置于-80℃冰箱中保藏。 5 復蘇方法 從冰箱中取出安瓿管或塑料凍存管,應立即放置38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當快速搖動。直到內部結冰全部溶解為止,約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內容物移至適宜的培養基上進行培養。


    液氮超低溫凍結法

    液氮超低溫保藏技術是將菌種保藏在-196℃的液態氮,或在-150℃的氮氣中的長期保藏方法,它的原理是利用微生物在-130℃以下新陳代謝趨于停止而有效地保藏微生物。

    操作步驟如下: 1 安瓿管或凍存管的準備 用圓底硼硅玻璃制品的安瓿管,或螺旋口的塑料凍存管。注意玻璃管不能有裂紋。將凍存管或安瓿管清洗干凈, 121℃下高壓滅菌15-20分鐘,備用。

    2 保護劑的準備 保護劑種類要根據微生物類別選擇。配制保護劑時,應注意其濃度,一般采用10-20%甘油。

    3 微生物保藏物的準備 微生物不同的生理狀態對存活率有影響,一般使用靜止期或成熟期培養物。 分裝時注意應在無菌條件下操作。 菌種的準備可采用下列幾種方法: 刮取培養物斜面上的孢子或菌體,與保護劑混勻后加入凍存管內; 接種液體培養基,振蕩培養后取菌懸液與保護劑混合分裝于凍存管內; 將培養物在平皿培養,形成菌落后,用無菌打孔器從平板上切取一些大小均勻的小塊(直徑約5-10毫米),真菌最好取菌落邊緣的菌塊,與保護劑混勻后加入凍存管內; 在小安瓿管中裝1.2-2毫升的瓊脂培養基,接種菌種,培養2-10天后,加入保護劑,待保藏。

    4 預凍 預凍時一般冷凍速度控制在以每分鐘下降1℃為好、使樣品凍結到-35℃。 目前常用的有三種控溫方法: —— 程序控溫降溫法,應用電子計算機程序控制降溫裝置,可以穩定連續降溫,能很好地控制降溫速率。 —— 分段降溫法:將菌體在不同溫級的冰箱或液氮罐口分段降溫冷卻,或懸掛于冰的氣霧中逐漸降溫。一般采用二步控溫,將安瓿管或塑料小管,先放-20℃至-40℃冰箱中1-2小時,然后取出放入液氮罐中快速冷凍。這樣冷凍速率大約每分鐘下降1-1.5℃。 —— 對耐低溫的微生物、可以直接放入氣相或液相氮中。

    5 保藏

    將安瓿管或塑料凍存管置于液氮罐中保藏。一般氣相中溫度為-150℃,液相中溫度為-196℃。

    6 復蘇方法 從液氮罐中取出安瓿管或塑料凍存管,應立即放置在38℃-40℃水浴中快速復蘇并適當搖動。直到內部結冰全部溶解為止,一般約需50秒-100秒。開啟安瓿管或塑料凍存管,將內容物移至適宜的培養基上進行培養。



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