一、背景
人多發性骨髓瘤細胞是從一位對類固醇療法產生抗藥性的多發性骨髓瘤患者的外周血中建立的。MM.1R對地塞米松耐藥。近緣細胞系MM.1S也是從MM.1中分離出來的，但對地塞米松敏感。
多發性骨髓瘤是在一種白細胞（稱作漿細胞）中形成的癌癥。健康的漿細胞通過產生識別并攻擊微生物的抗體輔助您對抗感染。
在多發性骨髓瘤中，癌性漿細胞聚集在骨髓內并擠走健康的血細胞。癌細胞非但不產生有益的抗體，反而產生可能引起并發癥的異常蛋白。
多發性骨髓瘤并不一定需要立即治療。如果多發性骨髓瘤生長緩慢且沒有引起體征和癥狀，醫生可能建議密切監測而非立即治療。對于需要治療的多發性骨髓瘤患者，多種治療方案可用于輔助控制病情。
二、人多發性骨髓瘤細胞培養操作
1)復蘇人多發性骨髓瘤細胞：以下細胞培養凍存處理僅供參考，具體操作步驟以隨貨產品說明書為主。
將含有1 mL人多發性骨髓瘤細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加4 mL培養基混合均勻。在1000 rpm條件下離心3 min，棄去上清液，加1-2 mL培養基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入含適量培養基的培養瓶中培養過夜（或將細胞懸液加入6 cm皿中，加入約4 mL完全培養基，培養過夜）。第三天換液并檢查細胞密度。
2)人多發性骨髓瘤細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
a、棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗人多發性骨髓瘤細胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.02%EDTA）于培養瓶中，使消化液浸潤所有細胞，將培養瓶置于37℃培養箱中消化1-3min（視細胞消化情況而定），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加2-3ml完全培養基終止消化。輕輕打勻后裝入無菌離心管中，1000 rpm離心5 min，棄去上清液，補加1-2 mL培養液后吹勻。
c、將人多發性骨髓瘤細胞懸液按1:2比例分到新的含8 mL培養基的新皿中或者瓶中，置于培養箱中培養。
3)人多發性骨髓瘤細胞凍存：待細胞生長狀態良好時，可進行細胞凍存。下面T25瓶為例；
a、收集細胞及細胞培養液，裝入無菌離心管中，1000 rpm條件下離心4 min，棄去上清液，用PBS清洗一遍，棄盡PBS，進行細胞計數。
b、根據細胞數量加入無血清細胞凍存液，使細胞密度5×106~1×107/mL，輕輕混勻，每支凍存管凍存1mL細胞懸液，注意凍存管做好標識。
c、將凍存管放入-80℃冰箱，24 h后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。
三、應用
人多發性骨髓瘤細胞可以用于NUPR1基因對人多發性骨髓瘤細胞自噬及凋亡的影響及機制研究：
研究NUPR1基因及自噬標記物在多發性骨髓瘤(Multiple myeloma,MM)患者骨髓的表達。構建慢病毒沉默NUPR1基因,轉染MM細胞株,創新性探討NUPR1基因對MM細胞自噬及凋亡的影響及機制。
方法：
1、收集初診MM患者骨髓標本28例,健康志愿者骨髓標本10例,同時收集上述患者臨床信息。提取骨髓標本單個核細胞,檢測骨髓NUPR1和自噬標記物mRNA相對表達量,分析NUPR1、自噬標記物及患者臨床特征的相關性。
2、體外細胞實驗:構建靶向NUPR1基因shRNA慢病毒及陰性對照慢病毒,轉染人MM細胞株(U266和RPMI 8226)。實驗分為三組:未轉染病毒空白組(Blank)、陰性對照慢病毒轉染組(NC-LV)和NUPR1shRNA慢病毒轉染組(NUPR1-LV)。應用流式細胞術檢測轉染效率,qRT–PCR及Western blot驗證NUPR1沉默效果。透射電子顯微鏡(TEM)和單丹磺酰尸胺(MDC)染色檢測NUPR1沉默對MM細胞自噬活性的影響;流式細胞術和Hoechst染色評估各組細胞凋亡情況;Western blot評估MM細胞自噬、凋亡相關蛋白及PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白表達情況。以自噬誘導劑雷帕霉素(RAPA)、自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)及PI3K抑制劑LY294002處理MM細胞,Western blot檢測相關蛋白表達水平。
結果：
1、MM患者骨髓單個核細胞NUPR1基因表達及自噬活性呈高水平:NUPR1基因及自噬標記物(Beclin1、ATG5和ATG12)mRNA水平在初診MM患者骨髓標本中表達增加,且NUPR1與Beclin1、ATG5和ATG12基因水平呈正相關關系。骨髓NUPR1高表達與患者臨床分期(RISS和D-S分期)?血鈣水平和骨髓漿細胞數比例呈正相關,與血紅蛋白水平負相關。
2、NUPR1 shRNA慢病毒成功轉染人MM細胞:流式細胞術示NC-LV和NUPR1-LV組細胞轉染率均達80%以上,qRT–PCR及Western blot證實NUPR1沉默效果顯著。
3、沉默NUPR1導致MM細胞自噬活性降低:TEM結果示NUPR1-LV組自噬小體較Blank和NC-LV組明顯減少,MDC也顯示NUPR1沉默組自噬顆粒減少,Western blot結果表明與Blank和NC-LV組相比,NUPR1-LV組LC3 II/LC3 I比值和Beclin1表達下調,P62蛋白表達上調。
4、沉默NUPR1激活MM細胞凋亡:流式細胞術檢測顯示NUPR1-LV組凋亡率較NC-LV組明顯增加,Hoechst染色也顯示NUPR1-LV組凋亡細胞增加,且NUPR1沉默后MM細胞cleaved caspase3和BAX蛋白表達升高,BCL2表達降低。
5、NUPR1沉默通過抑制自噬活性促進MM細胞凋亡:RAPA處理后,Western blot發現NUPR1-LV組細胞自噬水平增加、凋亡減少;而3-MA干預后,NUPR1沉默組細胞自噬受抑、凋亡增加。
6、NUPR1通過PI3K/AKT/mTOR通路影響MM細胞自噬及凋亡:沉默NUPR1后MM細胞總PI3K、AKT、mTOR表達無明顯變化,而磷酸化PI3K、AKT、mTOR表達增加;PI3K抑制劑LY294002處理引起細胞自噬活性增加凋亡水平降低。
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